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  • HPLC法測定生物樣品中淫羊藿苷的濃度

    發布于 2011/04/15閱讀(3949)來源 zxj

    摘要

    以苯甲酸為內標,建立了HPLC測定動物血漿、尿、糞及心、肝、脾、肺、腎等組織勻漿中淫羊藿苷的濃度。

    內容

    淫羊藿苷(Icariin,ICA)是來源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿(Epimedium)植物的主要有效成分。國內已有報道用紫外分光光度法[1]、高效薄層掃描法[2]及用外標法定量的高效液相色譜法3,4]測定淫羊藿制劑中淫羊藿苷的含量。有關生物樣品中淫羊藿苷濃度的測定方法國內外均未見報道,本文選擇了苯甲酸作內標,建立了生物樣品中淫羊藿苷高效液相色譜法,為進行淫羊藿苷的藥物動力學研究提供了一個靈敏、可靠的檢測手段。
    1 儀器、試藥和動物

    日本島津LC—6A高效液相色譜系統,SPD—6AV紫外檢測器;SCL—6A系統控制器;SIL—6A自動進樣器;CTO—6A恒溫箱;CR—3A數據處理機。ICA對照品由沈陽藥科大學植化教研室提供,純度在99%以上;苯甲酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供;淫羊藿提取液(含ICA 5mg/mL)由沈陽藥科大學藥劑教研室提供。甲醇為色譜純試劑,四氫呋喃、冰醋酸、乙酸乙酯均為分析純試劑。動物為Wistar大鼠,雌雄兼用,體重282~316g,由沈陽藥科大學動物室提供。2 色譜條件色譜柱:Zorbax ODS(10μm,4.6mm×250mm);流動相:四氫呋喃—水—冰醋酸(20∶75∶5);流速:1.0mL/min;紫外檢測波長:270nm;色譜柱柱溫:35℃;檢測靈敏度:0.02AUFS;紙速:2mm/min。3 生物樣品的處理3.1 血漿 取樣品0.1mL置10mL離心管中,加入乙酸乙酯3.5mL,振蕩3min,離心(2000r/min,5min),移取上清液,于50℃水浴用氮氣吹干,殘渣加內標液100μL,振蕩溶解后進樣20μL。3.2 糞和尿 大鼠糞便樣品室溫風干稱重后,置乳缽內研成細末,用生理鹽水按10%稀釋使成混懸液。取混懸液0.5mL及尿樣0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取2次,合并2次提取液,于50℃水浴用氮氣吹干,加入甲醇1.0mL,振蕩溶解后進樣10μL。3.3 組織勻漿 將大鼠斷頭處死取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腦、睪丸各組織;稱重,用組織勻漿器制成生理鹽水勻漿,使每1mL含各組織0.4g,取此勻漿0.2mL,按血漿樣品處理,進樣分析。4 結果與討論4.1 色譜行為 在上述色譜條件下,ICA與內標、淫羊藿提取液中的其它6種成分及血漿內源物質得到良好分離,ICA及內標保留時間分別為:7.92、11.93min。

     

    4.2 標準曲線的制備 用甲醇精密配制成1mg/mL ICA標準貯備液,再用甲醇稀釋成100μg/mL標準工作液,置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL內標貯備液,再用甲醇稀釋成40μg/mL標準工作液,置冰箱保存。用ICA標準工作液及空白生物樣品配制標準系列,同各樣品預處理操作,以ICA與IS峰高比為縱坐標,ICA濃度為橫坐標繪制標準曲線,計算回歸方程及相關系數。由于糞和尿中的代謝產物干擾內標色譜峰,因此糞和尿采用外標法,以ICA峰高為縱坐標,ICA濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果血漿、尿、組織勻漿和糞的線性范圍分別為:1~128、2~32、2~32、4~64μg/mL。血漿的標準曲線方程(n=6)為:Y=0.122X-0.0099 r=0.9999其它生物樣品標準曲線方程的r值均大于0.99。4.3 回收率分別于空白血漿中準確加入一定量的ICA標準工作液,按上述方法經提取后進行HPLC分析,按血漿標準曲線方程測得濃度,求出方法回收率。標準品經提取后,與標準品直接進樣測定所得各對應標準品與內標峰高比值相比求得血漿樣品的提取回收率,見表1。其它生物樣品的方法回收率均大于95.26%,提取回收率均大于73.57%。

    表1 血漿樣品的回收率和精密度(n=5)

    藥物濃度
    (μg/mL)
     測定濃度
    (μg/mL)
     方法回收率
    (±SD,%)
     提取回收率
    (±SD,%)
      
     精密度RSD(%)
    日內 日間
     
    2
     2.02±0.06
     101.0±3.0
     80.35±3.5
     2.0
     3.0
     
    8
     8.42±0.46
     105.2±5.8
     81.41±4.5
     3.1
     5.5
     
    32
     31.23±0.76
     97.60±2.4
     81.07±2.0
     2.0
     2.6
     
    128
     129.7±4.84
     101.4±3.8
     83.63±3.1
     3.4
     3.7
     

     4.4 精密度 用空白血漿配制含ICA 2、8、32、128μg/mL樣品每種濃度各5管測定日內及日間誤差,結果見表1。其它生物樣品的日內、日間相對標準偏差(RSD)均小于7.1%。4.5 靈敏度測定 按色譜峰信噪比(S/N)為3作為檢測下限,結果顯示ICA的最低檢測濃度為0.5μg/mL。4.6 色譜分析條件選擇 淫羊藿提取液中的主要化學成分為淫羊藿苷,還有其它黃酮類化合物存在,因此在上述色譜條件下可出現6~7個峰。為了獲得最佳分離效果,首先用甲醇—水為流動相進行分離,當比例 為55∶45時,雖然ICA與其它化學成分已分離,但其保留時間較長,峰形較寬,且柱壓較高。為此,選用對黃酮類化合物分離選擇性較好的四氫呋喃,并加入一定量的冰醋酸,使弱酸化合物分離效果更佳。經過調整不同比例,多次試驗,最后確定四氫呋喃—水—冰醋酸最佳配比為20∶75∶5。4.7 內標選擇 為能用內標法準確測定ICA濃度,本文對槲皮素、蘆丁、橙皮苷、氨茶堿、阿斯匹林、非那西丁、黃體酮、苯甲酸和蘭萼甲素等13種藥物進行了測定,考察其與ICA在血漿中的分離情況,結果用保留時間小于ICA的藥物選作內標時,往往被血漿中干擾峰所干擾。阿斯匹林、非那西丁均在ICA前1~1.5min出峰,卻被淫羊藿提取液中其它成分所干擾。蘭萼甲素和苯甲酸均在ICA后2~4min出峰,沒有任何峰的干擾,因此二者均可作為內標,考慮到苯甲酸方便易得,故認為選用苯甲酸作為內標更為適宜。4.8 提取溶媒的選擇 本文考察了用乙醇、乙酸乙酸及乙醇—乙酸乙酯(1∶5)為溶媒對ICA進行提取測定,發現前者提取回收率小于60%,而后者雖然提取回收率大于95%,但帶入雜質峰較多,而且色譜系統穩定性下降。因此實驗選用乙酸乙酯為提取溶媒,各生物樣品的提取回收率均大于73%,且方法穩定。4.9 藥物在生物樣品的穩定性 于空白各生物樣品中加入ICA標準品,配制成15μg/mL濃度生物樣品數份,置入-20℃冰箱保存,分別于第0、5、15、30d按實驗方法測定, RSD均小于7.1%, 說明該藥物在各生物樣品中-20℃冰箱保存下,至少可穩定1個月。4.10 血藥濃度的測定 為了檢驗上述方法是否能滿足ICA的藥代動力學研究,應用本方法進行了大鼠靜脈注射淫羊藿提取液。由大鼠頸靜脈按10mg/kg(含ICA)靜脈注射,于給藥后5、10、15、20、25、30、40、60、80、120、180min于頸靜脈各取血0.25mL,肝素抗凝,離心后取血漿0.1mL按上述方法提取和測定ICA濃度,以給藥時間為橫坐標,血漿中ICA的對數濃度為縱坐標繪制藥時曲線,見圖2。血藥濃度測定結果表明,本文建立的分析方法可滿足ICA藥代動力學研究的需要,具有靈敏度高,準確性好等優點。

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