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  • 本昂色譜儀高效液相色譜儀分離原理

    發(fā)布于 2013/04/25閱讀(1486)來(lái)源 zxj標(biāo)簽 高效液相

    摘要

    本昂色譜儀高效液相色譜儀分離原理

    內(nèi)容

    本昂色譜儀高效液相色譜儀分離原理
    液—液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 
      流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶(極性不同,避免固定液流失),有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱,溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí),服從于高效液相色譜計(jì)算公式:
        高效液相色譜計(jì)算公式式中,cs—溶質(zhì)在固定相中濃度;cm--溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度; Vs—固定相的體積;Vm—流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處,即分離的順序取決于K,K大的組分保留值大;但也有不同之處,GPC中,流動(dòng)相對(duì)K影響不大,LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大。
      a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。
      b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。
      
    液—固色譜法
      流動(dòng)相為液體,固定相為吸附劑(如硅膠、氧化鋁等)。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是:當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí),溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子(S)對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附(未進(jìn)樣時(shí),所有的吸附劑活性中心吸附的是S),可表示如下:Xm nSa ====== Xa nSm
      式中:Xm--流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子;Sa--固定相中的溶劑分子;Xa--固定相中的溶質(zhì)分子;Sm--流動(dòng)相中的溶劑分子。
      當(dāng)吸附競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)平衡時(shí):
      K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
      式中:K為吸附平衡常數(shù)。[討論:K越大,保留值越大。]
     
    離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)
      IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流離子交換色譜柱動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換,依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例,其交換過(guò)程可表示如下:
      X-(溶劑中) (樹(shù)脂-R4N Cl-)=== (樹(shù)脂-R4N X-) Cl- (溶劑中)
      當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí):
      KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-]
      分配系數(shù)為:
      DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-]
      [討論:DX與保留值的關(guān)系]
      凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離。
     
    離子對(duì)色譜法(Ion Pair Chromatography)
      離子對(duì)色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 ( 稱為對(duì)離子或反離子 ) 加到流動(dòng)相或固定相中,使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物,從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原離子色譜儀流程示意理可用下式表示:X 水相 Y-水相 === X Y-有機(jī)相.
      式中:X 水相--流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子(也可是陽(yáng)離子);Y-水相--流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(duì)(如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等);X Y---形成的離子對(duì)化合物。
      當(dāng)達(dá)平衡時(shí):
      KXY = [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相[Y-]水相
      根據(jù)定義,分配系數(shù)為:
      DX= [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相
      離子對(duì)色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問(wèn)題,諸如酸、堿和離子、非離子混合物,特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。
     
    離子色譜法(Ion Chromatography)
      用離子交換樹(shù)脂為固定相,電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器,為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾,設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。
      以陰離子交換樹(shù)脂(R-OH)作固定相,分離陰離子(如Br-)為例。當(dāng)待測(cè)陰離子Br-隨流動(dòng)相(NaOH)進(jìn)入色譜柱時(shí),發(fā)生如下交換反應(yīng)(洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過(guò)程):
        擔(dān)體圖示抑制柱上發(fā)生的反應(yīng):
      R-H Na OH- === R-Na H2O
      R-H Na Br- === R-Na H Br-
      可見(jiàn),通過(guò)抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水,消除了本底電導(dǎo)的影響;試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-,可用電導(dǎo)法靈敏的檢測(cè)。
      離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽(yáng)離子分析。
     
    空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)
      空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用,但凝膠的孔徑比分子篩要大得多,一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離,而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后,隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻,因此就直接通過(guò)柱子,首先在色譜圖上出現(xiàn),一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中,這些組分在柱上的保留值最大,在色譜圖上最后出現(xiàn)。


     

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