高效液相色譜法測定蜂王漿中羥甲基糠醛含量

羥甲基糠醛是美拉德反應的產物[1-3]。在一些富含碳水化合物的食品中，羥甲基糠醛通常是由果糖脫水生成，當葡萄糖受酸和熱的影響時也能產生此物質。羥甲基糠醛的含量是研究食品在加工貯藏過程中質量發生變化的一個重要參數，是衡量許多產品質量優劣的一項重要指標[4-5]。食用含過多糠醛的食品可能會對人體健康造成傷害[ 6 ]，可能導致突變和引起D N A 鏈斷裂。因此，世界各國均對食品中羥甲基糠醛的含量做了限量規定，一般不得超過2 0 m g / k g 。
羥甲基糠醛含量的測定方法主要有紫外分光光度法[ 7 ]、液相色譜法[ 8 - 1 5 ]、液相色譜質譜法[ 16 ]和氣相色譜質譜法[ 1 7 - 1 9 ]。這些方法主要適用于蜂蜜、果汁、面包等食品中羥甲基糠醛的測定。
蜂王漿含有大量的蛋白、糖和酸類物質，在其存貯和加工過程中必然會發生美拉德反應和糖的水解反應，也會產生糠醛類物質[ 2 0 ]。測定蜂王漿中羥甲基糠醛量有助于對蜂王漿新鮮度及其存貯、加工條件進行評價。但目前還沒有蜂王漿中羥甲基糠醛含量檢測方法的報道。
本實驗在參考前人研究的基礎上，對提取方法、線性范圍、方法適用性等方面進行研究，結合實際樣品的測定，建立一種穩定、靈敏度高、適應性好的蜂王漿中羥甲基糠醛含量的測定方法。
1 材料與方法
※分析檢測食品科學2008, Vol. 29, No. 03 413
1.1 儀器與試劑
P 6 8 0 高效液相色譜儀 D i n o e x 公司；固相萃小柱ENVI-C18(500mg，6ml)；固相萃取裝置 Supelco 公司；Turbo Vap LV 氮氣吹干儀；離心機 Sigma 公司。羥甲基糠醛標準品(97.0%) Sigma公司；磷酸(優級純) ；甲醇(色譜純) ；乙酸鋅溶液(150g/L)；亞鐵氰化鉀溶液(300g/L)；10% 的甲醇水溶液(10ml 甲醇與90ml水混合)；實驗用水為超純水。
標準溶液的配制：準確稱取標準品，用去離子水配制成0.5mg/ml 的儲備液。分析前用流動相配制成一系列不同濃度的標準工作溶液。
1.2 樣品處理
稱取5g 試樣，精確到0.001g，置于50ml 容量瓶中，加入30ml 水振蕩溶解。待樣品溶解后，分別加入3ml 乙酸鋅溶液和3 m l 亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白，用水定容至刻度，混勻，靜置1 0 m i n 。將溶液轉移到離心管中，在5 0 0 0 r / m i n 離心1 0 min，取上清液，待凈化。將E N V I - C 1 8 萃取柱固定在萃取裝置上，分別加入5ml 甲醇、10ml 純水活化平衡，保持柱的濕潤。取15ml濾液到固相萃取柱中，上清液以不大于3ml/min 流速通過固相萃取柱，待液體完全流完后，用5 m l 1 0 % 甲醇水溶液清洗固相萃取小柱；真空減壓抽干后，用5 m l 甲醇洗脫于1 0 m l 刻度試管中。將洗脫液用氮吹儀吹干后，用0.5ml 流動相溶解，樣液經過0.45μm 的濾膜過濾后，上液相色譜儀測定。
1.3 液相色譜條件
色譜柱: Waters Symmetry-C18(4.6mm × 250mm，5μm ，W a t e r s 公司)；流動相：0 . 4 % 磷酸水溶液+ 甲醇(90+10)；流速0.8ml/min；檢測波長285nm；柱溫30℃；進樣量2 0μl。
2 結果與分析
2.1 提取方法的優化
2.1.1 沉淀劑的選擇
常用的沉淀蜂王漿蛋白的試劑有無水乙醇溶液，磷酸溶液，鹽酸溶液，偏磷酸溶液，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液等，經過實驗，這些溶液均能很好的將蜂王漿中的蛋白沉淀。但由于羥甲基糠醛對強酸，熱和氧化劑敏感，當用磷酸、鹽酸、偏磷酸溶液時，羥甲基糠醛的回收率很低，有可能在提取過程中，發生了分解。8 0 % 的乙醇水溶液對蜂王漿中羥甲基糠醛提取有很高的回收率，但在進一步凈化前，需要用蒸發儀蒸干，而由于乙醇和水的混合液沸點很高，需要長時間的揮發，這不僅延長了測試樣品的時間，而且在揮發的過程中羥甲基糠醛很容易降解，因此本實驗選擇乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑。通過優化實驗確認，乙酸鋅溶液的濃度為150g/L；亞鐵氰化鉀溶液濃度為300g/L，各使用3 m l 就可以有效的將蜂王漿中蛋白沉淀，并獲得很好的提取回收率。
2.1.2 固相萃取小柱的選擇
對比了BAKERBOND SPETM C18(500mg/6ml)；ODS(C18)PHASE(500mg/6ml)；ACCUBOND ODS(C18)(500mg/6ml)；Oasis HLB(500mg/6ml)小柱和ENVI-C18(500mg/6ml)五種反相固相萃取柱對蜂王漿樣品的凈化效果。實驗表明，五種固相萃取柱差異較大，EN V I - C 1 8 小柱的回收率最高(90% 以上)，Oasis HLB 和BAKERBOND SPETM C18的回收率在7 5 %～8 5 %，O D S ( C 1 8) P H A S E 和A C C U B O N DO D S ( C 1 8 )柱的回收率在6 0 %～8 0 %。因此，本方法選擇E N V I - C 1 8 固相萃取柱為凈化柱。
2.2 液相色譜柱的選擇
分別選用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm，5μm)，Diamonsil C18 (4.6mm × 250mm，5μm)，Waters Nova-Pak C18 (3.9mm × 150mm，5μm)，μBondapak C18 (4.0mm× 3 0 0 m m，1 0μm )四種色譜柱對蜂王漿中羥甲基糠醛進行了色譜條件的實驗。實驗發現，這四種色譜柱都可以用于對羥甲基糠醛含量的分析，只有保留時間和靈敏度有所不同，Symmetry C18 柱靈敏度和峰型均很好，所以我們選用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm，5μm)色譜柱進行羥甲基糠醛的測定。標準圖譜與實際樣品分離圖譜
見圖1 。
2.3 線性關系和檢出限
用羥甲基糠醛標準儲備溶液分別配制濃度為0 . 1 0、0.20、1.0、2.0、5.0、20.0mg/L 標準溶液，在選定的色譜條件下進行測定，進樣量2 0μl ，用峰高與標準濃度作圖，線性方程為Y=2.3772X+0.024，線性相關系數R2=0.9993。當檢測0.10mg/L 標準濃度時，所測譜圖的信噪比大于1 0 。根據最終樣液所代表的試樣量、定容體積和進樣量計算，確定本方法檢出限為0 . 2 m g / k g。
2.4 回收率和精密度
在樣品上做0.2、1、5、10mg/kg 四個添加水平的加標回收率實驗，每個濃度重復四次，測定的平均回收率及精密度見表1。在0.2～10mg/kg 添加濃度范圍內，回收率在87.2%～93.1% 之間，相對標準偏差小于3.4%，能夠滿足蜂王漿中羥甲基糠醛含量的常規分析。
2.5 實際樣品的測定
添加濃度 (mg/kg) 0.2 1 5 10
回收率Intra-daya 89.4±3.4 89.2±2.1 92.2±2.3 93.1±1.1(%, X ± SD) Inter-dayb 87.2±3.1 91.7±3.2 91.2±2.7 92.3±2.5
表 1 蜂王漿中羥甲基糠醛的添加回收率Table 1 Recoveries of hydroxymethylfurfural in royal jelly
注：Intra-daya 為日內添加回收率，測定4次；Inter-dayb 為日間添加回收率，測定4 次。
414 2008, Vol. 29, No. 03 食品科學※分析檢測隨機從市場上購買的蜂王漿樣品1 4 個，采用本實驗建立的高效液相色譜方法對樣品進行分析，實際測定結果見表2 。
結果表明，大多數樣品中都檢出了羥甲基糠醛，檢出樣品中羥甲基糠醛的含量在0.9～26.4mg/kg 之間。羥甲基糠醛有可能能成為評價蜂王漿質量和貯存效果的指標之一。
3 結 論
蜂王漿樣品基質復雜，富含蛋白質、脂類等物質。本實驗采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉降蛋白，結合固相萃取方法，有效地降低了基質干擾。方法回收率在87.2%～93.1% 之間，相對標準偏差為0.9%～3.4%，該方法具有方便、準確、靈敏度高、精密度好等優點，是一種測定蜂王漿中羥甲基糠醛的有效方法。