1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)的檢驗(yàn)。
本方法的檢出限為4U/mL。
2 原理
該方法采用對(duì)青霉素類藥物絕對(duì)敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對(duì)照，通過比對(duì)加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產(chǎn)生的抑制圈的大小來間接測(cè)定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。
3 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
3.1 抑菌圈測(cè)量?jī)x或測(cè)量尺。
3.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。
3.3 高壓滅菌器。
3.4 無菌培養(yǎng)皿:內(nèi)徑90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦蓋。
3.5 無菌牛津杯：外徑(8.0士0.1) mm，內(nèi)徑(6.0士0.1) mm，高度(10.0士0.1) mm。
3.6 麥?zhǔn)媳葷醿x或標(biāo)準(zhǔn)比濁管。
3.7 pH計(jì)。
3.8 無菌吸管：1mL（0.01mL刻度值），10mL（0.1mL刻度值）。
3.9 加樣器:5μL～20μL，20μL -200μL及配套吸頭。
4 培養(yǎng)基和試劑
除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。
4.1 試驗(yàn)菌種：藤黃微球菌(Micrococcus luteus) CMCC(B) 28001，傳代次數(shù)不得超過14次。
4.2 磷酸鹽緩沖溶液：按附錄A中A.1規(guī)定。
4.3生理鹽水（8.5 g/L）：按附錄A中A.2規(guī)定。
4.4 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：按附錄A中A.3規(guī)定。
4.5 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液：按附錄A中A.4規(guī)定。
4.6 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液按附錄A中A.5規(guī)定。。
4.7 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按附錄A中A.6規(guī)定。
4.8 抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ：按附錄A中A.7規(guī)定。
5.操作步驟
5.1 菌懸液的制備
將藤黃微球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，經(jīng)36士1℃培養(yǎng)18h-24 h，用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液，測(cè)定菌懸液濃度，終濃度應(yīng)大于1×1010 CFU/mL，4 ℃保存，貯存期限2周。
5.2 樣品的制備
將待檢樣品充分混勻，取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管，分別標(biāo)為：A、B、C、D，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，共12 管，同時(shí)每次檢驗(yàn)應(yīng)取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對(duì)照。如樣品為乳粉，則將乳粉按1:10的比例稀釋。如樣品為酸性乳制品，應(yīng)調(diào)節(jié)pH值至6-7。
5.3 檢驗(yàn)用平板的制備
取90mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿，底層加10 mL滅菌的抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108 CFU/mL藤黃微球菌的抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后備用。
5.4 樣品的測(cè)定
按照下列順序分別將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品及純水中：
A 青霉素5 μL。
B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
C β-內(nèi)酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。
D β-內(nèi)酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
混勻后，將上述A～D 試樣各200 μL 加入放置于檢驗(yàn)用平板上的4個(gè)無菌牛津杯中，36士1℃培養(yǎng)培養(yǎng)18～22 h ，測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)樣品，取三次平行試驗(yàn)平均值。
5.5 結(jié)果報(bào)告
純水樣品結(jié)果應(yīng)為：（A）、（B）、（D）均應(yīng)產(chǎn)生抑菌圈；（A）的抑菌圈與（B）的抑菌圈相比，差異在3 mm以內(nèi)(含3 mm)，且重復(fù)性良好；（C）的抑菌圈小于（D）的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復(fù)性良好。如為此結(jié)果，則系統(tǒng)成立，可對(duì)樣品結(jié)果進(jìn)行如下判定。
7.1 如果樣品結(jié)果中（B）和、（D）均產(chǎn)生抑菌圈，且（C）與（D）抑菌圈差異在3 mm以上（含3 mm）時(shí)，可按7.1.1、7.1.2 判定結(jié)果。
7.1.1（A）的抑菌圈小于（B）的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm),且重復(fù)性良好，應(yīng)判定該試樣添加有β- 內(nèi)酰胺酶，報(bào)告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陽性。
7.1.2（A）的抑菌圈同（B）的抑菌圈差異小于3 mm，且重復(fù)性良好，應(yīng)判定該試樣未添加有β- 內(nèi)酰胺酶，報(bào)告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陰性。
7.2 如果（A）和（B）均不產(chǎn)生抑菌圈，應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。
附 錄 A
（規(guī)范性附錄）
培 養(yǎng) 基
A.1 磷酸鹽緩沖溶液（pH6.0）
無水磷酸二氫鉀 8.0 g
無水磷酸氫二鉀 2.0 g
蒸餾水 加至1000 mL
A.2 生理鹽水（8.5 g/L）
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1000 mL
121℃高壓滅菌15 min。
A.3 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液
準(zhǔn)確稱取適量青霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)天配制，當(dāng)天使用。
A.4 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液
準(zhǔn)確量取或稱取適量β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為16000 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)天配制，當(dāng)天使用。
A.5 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液
準(zhǔn)確稱取適量舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆茫豢煞磸?fù)凍融使用。
A.6 營(yíng)養(yǎng)瓊脂
蛋白胨 10 g
牛肉膏 3 g
氯化鈉 5 g
瓊脂 15-20 g
蒸餾水 1000 mL
將上述成分加入蒸餾水中，攪混均勻，分裝試管每管約5~8 mL，120℃高壓滅菌15 min，滅菌后擺放斜面。
A.7 抗生素檢測(cè)培養(yǎng)基Ⅱ
蛋白胨 10 g
牛肉浸膏 3 g
氯化鈉 5 g
酵母膏 3 g
葡萄糖 1 g
瓊脂 14 g
蒸餾水 1000mL
將上述成分加入蒸餾水中，攪混均勻，120 ℃高壓滅菌15 min，其最終pH 值約為6.6。