葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下使鄰聯(lián)甲苯胺生成藍(lán)色物質(zhì)，此有色物質(zhì)在625nm波長下與葡萄糖濃度成正比。通過測定藍(lán)色物質(zhì)的吸光度可計算樣品中葡萄糖的含量。
2.適用范圍
適用于谷類、乳類、飲料、酒類等食物樣品和血液樣品。檢出量為0.02 mg。
3.儀器
722分光光度計。
4.試劑：
除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。
（1） 乙醇。
（2） 40% 三氯乙酸：稱取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀釋至100ml。
（3） 2 mol/L NaOH 溶液：稱取8g NaOH， 用水溶解并稀釋至100ml。
（4） 1 % 鄰聯(lián)甲苯胺溶液：稱取0.1 g 鄰聯(lián)甲苯胺溶解于10 ml無水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。
（5） 乙酸緩沖液 （pH 5.0）：稱取14.28 g 乙酸鈉 （CH3COONa?3H2O）溶于水中，加入2.7 ml冰乙酸，并調(diào)節(jié)pH 5.0， 用水定容至1 L。
（6） 葡萄糖氧化酶溶液：稱取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma 公司）用水溶解，使酶含量為100 U/ml。4 ℃冰箱保存一周。
（7） 過氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根過氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。
（8） 酶溶液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃冰箱可保存七周。
（9） 酶空白液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）
（10） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%）于80 ℃干燥至恒量。精確稱取0.050 g，用水移入100 ml容量瓶中，定容至刻度線。相當(dāng)于濃度為0.5 mg/ml。
5.操作步驟：
5.1樣品處理：
（1）固體樣品：稱取0.5～5g已粉碎的樣品于錐形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷卻后，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反復(fù)搖動混勻樣品，過濾，棄初始幾滴濾液。收集濾液。如果濾液澄清，可直接或經(jīng)進(jìn)一步稀釋后用于測定。如果濾液渾濁，吸取20ml濾液轉(zhuǎn)移至另一容量瓶中，加入無水乙醇至刻度。混合后靜置至少30min。過濾，濾液用于測定。
（2）液體樣品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml樣品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。靜置至少30min，過濾后濾液備用。（如果過濾后濾液仍渾濁，或樣液體積過少，可3000rpm離心15min，上清液備用。）
（3） 新鮮牛乳等樣品：吸取0.5～2ml 樣品，用水稀釋，加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml，過濾。吸取5ml濾液，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至中性，用水定容至10ml，備用。
（注：樣品處理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白質(zhì)，40% 三氯乙酸用于沉淀蛋白。）
5.2測定：標(biāo)準(zhǔn)管和樣品測定管，按下表所列操作（單位：ml）
　
試  劑
 標(biāo)準(zhǔn)空白管
 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管
 樣品空白管
 樣品測定管
 
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液
 ——
 0.1～0.5
 ——
 ——
 
樣品提取液
 ——
 ——
 0.5
 0.5
 
水
 0.5
 補(bǔ)至0.5
 ——
 ——
 
酶溶液
 5
 5
 ——
 5
 
酶空白液
 ——
 ——
 5
 ——
 

上述試劑混合后37℃ 水浴反應(yīng) 15 min， 625 nm 測定吸光度值。
（注意：葡萄糖與酶溶液的成色反應(yīng)與反應(yīng)時間密切相關(guān)，如反應(yīng)時間過長，溶液顏色會由藍(lán)轉(zhuǎn)變成灰色，并慢慢產(chǎn)生沉淀，所以反應(yīng)時間應(yīng)嚴(yán)格控制好。）
6.計算
根據(jù)吸光度值求出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，采用插入法求出樣品測定管中葡萄糖含量，再根據(jù)稀釋定容體積和稱樣量，計算出樣品中葡萄糖含量。
計算公式：
X= (As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中:
X——樣品中葡萄糖含量，g/100g;
As—— 由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出的樣品測定管中葡萄糖含量，mg；
Ab——由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出的樣品空白管中葡萄糖含量，mg；
V——樣品定容體積，ml；
F——稀釋倍數(shù)
0.5——測定時吸取樣品提取液的體積，ml；
m——樣品質(zhì)量，g；
0.1——將mg/g轉(zhuǎn)換成g/100g的系數(shù)。
7.注意事項
（1） 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反應(yīng)，特異性強(qiáng)，靈敏度高。
（2）如果樣品提取液為無色，無需做樣品空白。但是有些樣品顏色很深，如飲料、菌藻類食物，或樣品提取液渾濁，往往干擾測定結(jié)果但又難以去除，所以測定這類樣品時需做樣品空白管以減少干擾。