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  • 流式細胞儀操作規程

    發布于 2011/11/21閱讀(1652)來源 zxj標簽 流式細胞儀

    摘要

    流式細胞儀開機程序、預設獲取模式文件、設定和調整、樣品分析、關機程序

    內容

    流式細胞儀操作規程:

    一.開機程序
    1.檢查穩壓器電源,打開電源,穩定5分鐘。
    2.打開儲液箱,倒掉廢液, 并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥,取出鞘液桶,將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水,做分選必須用PBS或FACSFlow),合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋,檢查所有管路是否妥善安置。
    3.將FACSCalibur開關打開,此時儀器功能控制鈕的顯示應是STANDBY,預熱5-10分鐘。排出過濾器內的氣泡。
    4.如果需要打印,打開打印機電源。
    5.打開電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋果標志。
    6.執行儀器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的氣泡。
    7.分析樣品時,先用FACAFlow 或PBS進行HIGH RUN約2分鐘。
    ?做過分選后,每次開機后需沖洗管道:向分選裝置上裝上兩個50ml離心管,不接通濃縮系統,摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止后接通濃縮裝置,同上法沖洗一次。

    二.預設獲取模式文件(Acquisition Template Files)
    1.從蘋果標志中選擇CELLQuest見一個新視窗,可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。
    2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot,繪出一個或多個Dot Plots(點圖)。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源,并確定適當的x軸和y軸參數。
    3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram,同上法可繪出Histogram(直方圖)。
    4.將此視窗命名后儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中,下次進行相同實驗時可直接調用。
    ?本計算機中已設定兩個模式文件:ACQ和EXP,儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夾中,ACQ用于細胞DNA檢測,EXP用于細胞表面標志分析。

    三.用CELLQuest進行儀器的設定和調整
    1.從蘋果畫面中選取CELLQuest,進入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。
    2.從屏幕上方Acquire指令欄中,選取Connect to Cytometer(快捷鍵: +B)進行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話框移至合適位置。
    3.從Cytometer指令欄中,開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框,并將它們移至屏幕右方,以便獲取數據時隨時調整獲取條件。也可以用 +1,2,3,4獲得此四個對話框。
    4.在Detectors/Amps對話框中,先為每個參數選擇適當的倍增模式(amplifier mode):線性模式Lin或對數模式Log。一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時,FSC和SSC多以線性模式Lin測量,且DDM Param選擇FL2,而FL1, FL2與FL3則以對數模式Log測量;分析細胞DNA含量時,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin進行測量,且DDM Param選擇FL2;分析血小板表型時,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log進行測量。
    5.放上待檢測的樣品,將流式細胞儀設定于RUN,流速可在HIGH 或LOW上。
    6.在Acquisiton Control對話框中,選取Acquire,開始獲取細胞。在以下的儀器調整過程中隨時選取Pause,Restart以觀察調整效果。未完全調整好之前不要去掉SETUP前的“?”。
    7.在Detectors/Amps對話框中,調整FSC和SSC探測器中的信號倍增度:PMT voltages(粗調)與Amp Gains(細調),使樣品信號出現在FSC-SSC點圖內,且三群細胞合理分布。
    8.在Threshold 對話框中選擇適當的參數設定Threshold,并調整Threshold的高低,以減少噪音信號(細胞碎片)。一般做細胞表型時用FSC-H而做DNA時用FL2-H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取,但可改善畫面質量。
    9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區域),并在靶細胞周圍設定區域線,即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調整更為容易。
    10.Detectors/Amps對話框中,調整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據所用的熒光陰性對照樣品調整細胞群,使之分布在正確的區域內。
    11.在Compensation對話框中,根據所用的調補償用標準熒光樣品調整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補償。比如應該為FL1+ FL2- 的細胞群卻分布在FL1+ FL2+區域內,則需調大FL2-?%FL1中的“?”,并從FL1-FL2點圖中觀察新的調整是否恰當
    12.在Status對話框中可見:Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW,Standby為5mW;Laser current:正常值為6Amps左右。
    13.調整好的儀器設定可在Instrument Settings對話框中儲存,下次進行相同實驗時可調出使用,屆時只需微調即可。
    ?本計算機中已有三個名叫儲存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的參數文件,前二者可用于分析人白細胞,后者用于分析小鼠肥大細胞。

    四.通過預設的獲取模式文件進行樣品分析
    1.從蘋果標志中選擇CELLQUEST,新視窗出現后從File指令欄中選擇Open,打開預設的獲取模式文件。
    2.從屏幕上方Acquire指令欄中,選取Connect to Cytometer進行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話框移至合適位置。
    3.從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings,在其對話框中選擇Open以調出以前存儲的相同實驗的儀器設定,按Set 確定。
    4.在Acquire指令欄中,選擇Acquisition&Storage決定儲存的細胞數,參數,信號道數。其中Resolution在做細胞表面標志時選擇256,做DNA時選擇1024。Parameter Saved…則根據不同的檢測對象選擇不同的參數。
    5.在Acquire指令欄中,選擇Parameter Description,以決定文件存儲位置(folder),文件名稱(file),樣品代號以及各種參數的標記(panel),即安排tube1,2,3…的檢測參數。一般本儀器獲取的數據按照檢測對象的不同分別儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夾中。文件根據日期命名。
    6.在Cytometer指令欄中,選擇Counters,將此對話框移至合適位置,以便于隨時觀察events計數。
    7.將樣品試管放至檢測區,在Acquire Control對話框中選取Acquire以啟動樣品分析測定。
    8.微調儀器設定,待細胞群分布合適后選擇Acquire Control對話框中Pause, Abort, 去除Setup前的“?”,開始正式獲取信號,存儲數據。
    9.當一定數目的細胞被測定后,獲取會自動停止,并會自動存儲數據。重復步驟7,繼續分析下一個樣品,直到所有的樣品數據分析完畢。
    ?當所有樣品分析分析完畢,即換上三蒸水,并將流式細胞儀置于“STANDBY”狀態,以保護激光管。

    五.關機程序:
    1.從File中選擇Quit, 退出軟件,選擇Don’t Save至蘋果屏幕。
    2.用4ml 1:10稀釋的漂白水作樣品,將樣品置于旁位(vacuum is on),以外管吸去約2ml,在將樣品架置于中位(vacuum is off),再HIGH RUN 5分鐘(內管吸去2ml)。
    3.改用三蒸水4ml作樣品,同上處理。
    4.按Prime三次。
    5.此時儀器自動轉為STANDBY狀態,換2ml三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態 10分鐘后再依次關掉計算機、打印機、主機、穩壓電源,以延長激光管壽命,并確保應用軟件的正常運行。
    6.填寫使用登記表。

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