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  • 維生素D的液相測定方法

    發(fā)布于 2011/11/25閱讀(1799)來源 zxj標簽 維生素D

    摘要

    維生素D的液相測定方法

    內容

    維生素D的液相測定方法

    1. 原理
    樣品中脂溶性維生素在皂化過程中與脂肪分離,以石油醚萃取后,用正相色譜柱提取富集,用反相色譜柱,紫外檢測器定量測定。
    2. 適用范圍
    本方法來源于GB/T 5413.9-1997。適用于嬰幼兒配方食品和乳粉維生素A、維生素D、維生素E的測定;也適用于食品或強經(jīng)食品及飼料中的維生素D含量的測定。
    3. 主要儀器
    1) 高壓液相色譜儀,具有可變波長的紫外檢測器,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或記錄儀。
    2) 旋轉蒸發(fā)器。
    3) 平底燒瓶:250mL。
    4) 分液漏斗:500mL。
    4. 試劑
    所有試劑,如未注明規(guī)格,均指分析純,所實驗用水均指蒸餾水。
    1) 異丙醇:色譜純。
    2) 2%焦性沒食子酸乙醇溶液:取2g焦性沒食子酸溶液于100mL無水乙醇中。
    3) 75%氫氧化鉀溶液:取75g氫氧化鉀溶于100mL水中。
    4) 石油醚:沸程30~60℃。
    5) 甲醇:色譜純。
    6) 正己烷:色譜純。
    7) 環(huán)己烷:色譜醇。
    8) 維生素D標準溶液
    A. 維生素D2標準貯備液:含維生素D2100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D2,用甲醇定容于100mL容量瓶中。
    B. 維生素D3的標準貯備液:含維生素D3100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D3,用甲醇定容于100mL容量瓶中。
    5. 操作步驟
    5.1樣品處理:準確稱取10g樣品,于250mL平底燒瓶中,加30mL蒸餾水。
    5.2測定液的制備:
    1) 于上述樣品溶液中加入100mL的20%沒食子酸乙醇溶液,充分混勻后加50mL75%氫氧化鉀溶液,在蒸汽浴上邊續(xù)回流30min后,立刻冷卻到室溫。
    2) 將皂化液轉入一500mL分液漏斗中,用100mL水分幾次沖平底燒瓶。洗滌液并入分液漏斗中。
    3) 于上述分液漏斗中,加入100mL石油醚,蓋好瓶塞,倒置分液漏斗并劇烈振搖1min.在振搖過程中,注意釋放瓶內壓力。靜置分層,將水相放入另一500mL分液漏斗中,重復上棕萃取過程2次,合并醚液到第一個分液漏斗中。用蒸餾水洗該醚液至中性,通過無水硫酸鈉過濾干燥,在40℃和氮氣流下,于旋轉蒸發(fā)器上蒸至近于(絕不允許蒸干)后,用石油醚轉移至10mL容量瓶中,定容。
    4) 從上述容量瓶中取7mL放入一試管中,用氮氣將石油醚吹干,于試管中加1mL正己烷。
    5.3測定:
    1) 測定液的制備:
    A) 儀器條件:
    色譜柱:30cm×40cm,硅膠柱。
    流動相:正己烷與環(huán)己烷按體積比1:1混合,并按體積分數(shù)0.8%加入異丙醇。
    流速:1mL/min。
    波長:265nm。
    柱溫:20℃。
    靈敏度:0.005AU/MV。
    注射體積:200mL。
    B) 注射50mL維生素D標樣和200mL樣品溶液,根據(jù)維生素D標樣保留時間收集維生素D于試管中,將試管用氮氣吹干,準確加入0.2mL甲醇溶解。
    2) 測定步驟:
    A) 儀器條件:
    色譜柱:4.6mm×25cm,C18或具同等性能的色譜柱。
    流動相:甲醇。
    流速:1mL/min。
    波長:265nm。
    柱溫:20℃。
    靈敏度:0.005AU/MV。
    注射體積:50mL。
    B) 注射50mL維生素D標準溶液,注射50mL樣品溶液,得到標樣和樣品溶液中維生素D峰面積或峰高。
    6. 計算
    ρs×10∕7×40×100
    X =
    m

    As
    ρs= ---×ρsd
    Asd

    式中:X--樣品維生素D的量,mg/100g;
    m--稱樣量,含量,IU∕100g;
    ρs --進樣液中維生素D有濃度,mg/mL;
    A s --進樣液中維生素D有峰高(或峰面積);
    A s d --標樣液中維生素D有峰高(或峰面積);
    ρsd --標樣中維生素D的濃度;
    計算結果精確至小數(shù)點后一位。
    7. 注意事項
    1) 允許誤差及最小檢出量:同一樣品的2次測定值之差不得超過2次測定平均值的10%;最小檢出量為0.1國標單位。
    2) 試劑焦性沒食子酸容易變性,應購習近期生產(chǎn)的試劑。
    3) 如果皂化不完全,可適當增加氫氧化鉀的加入量。


     

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