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  • 血紅蛋白電泳檢查(電泳法)

    發布于 2011/12/21閱讀(2230)來源 zxj標簽 電泳法

    摘要

    血紅蛋白電泳檢查(電泳法)

    內容

    血紅蛋白電泳檢查(電泳法)
    1. 原理
    血紅蛋白是由兩對多肽鏈組成的復雜分子。每一條鏈含有血紅素和絡合鐵原子的卜啉。所有血紅蛋白的血紅素部分都是相同的。所測定的血紅蛋白的蛋白部分稱之為珠蛋白。正常人血紅蛋白多肽鏈包括α、β、δ和γ。血紅蛋白的結構、分子特性取決于形成其肽鏈的氨基酸順序和性狀。氨基酸不同可形成不同的血紅蛋白,其表面電荷不同,在電場中的泳動率不同。本實驗在堿性(PH=8.60)條件下,以瓊脂糖凝膠電泳的方法進行,對紅細胞洗滌后造成溶血,電泳分離血紅蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液體洗去。待瓊脂糖凝膠板干燥后,肉眼可直接判別有無電泳條帶異常。運用光密度掃描儀檢測準確定量分析電泳條帶異常情況。血紅蛋白異常有二種類型:血紅蛋白性質或結構的異常稱之為血紅蛋白病。血紅蛋白中的一條鏈合成減少引起血紅蛋白性質異常,稱之為地中海貧血。
    2. 標本采集
    2.1 標本采集前病人準備:受檢者應空腹。
    2.2 標本種類:抗凝血
    2.3標本要求:抗凝劑選用EDTA,檸檬酸或肝素均可,避免碘乙酸。常規靜脈采血1.8ml,加入含有109mmol/L枸櫞酸鈉溶液0.2ml的干燥。清潔試管中,充分混勻。
    4. 標本儲存:儲存于2-8℃冰箱中,5天。
    5. 標本運輸:儲存于2-8℃狀態下的冰壺或泡沫箱密封運輸。
    6. 標本拒收標準:細菌污染、溶血或脂血標本不能作測定。
    7. 試劑
    7.1 試劑名稱:血紅蛋白電泳檢查試劑
    7.2 試劑生產廠家:法國Sebia公司
    7.3 包裝規格:150tests
    7.4 試劑盒組成
    瓊脂糖凝膠 10塊 溶血素 1瓶
    緩沖液條帶 10包×2條 薄濾紙 1×10張
    氨基黑(濃縮液)1瓶×100ml 點樣模具濾紙 10條×1盒
    7.5 試劑儲存條件及有效期:貯存于室溫(15~30℃)或冰箱(2~8℃),不能冷凍。有效期兩年。
    8. 儀器設備
    8.1 儀器名稱:SEBIA電泳儀
    8.2 儀器廠家:法國Sebia公司
    8.3 儀器型號:HYDRASYS
    9. 操作步驟
    9.1血紅蛋白液制作:抗凝血離心,5000rpm,5分鐘,去掉血漿,用10倍體積的生理鹽水洗滌紅細胞3次,若紅細胞體積小于10ul,需特別小心。取10ul紅細胞加入130ul溶血液造成溶血。震蕩混勻10秒鐘,室溫下培育5分鐘待測。
    9.2 啟動電泳儀
    9.3將加樣器放在一平板上,有數字的一端向上。各加樣孔加入10ul溶血的樣品,2分鐘內加樣完畢。將加樣器放入保濕盒內,齒端向上(轉運時用塑料齒保護架)。等待5分鐘,使樣品擴散至齒端。打開電泳儀蓋,抬起電極和加樣器支架。
    9.4 使用HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINCE時選擇儀器的“HBTOTAL”程序(位于鏈盤左側)。
    9.5 從包裝袋內取出緩沖條,拿出末端的塑料片,將緩沖條兩端塑料片固定在電極支架背側的釘上,塑料片應緊貼支架。
    9.6取出凝膠板。將薄的濾紙輕輕吸去凝膠板表面的多余液體,然后立即丟棄濾紙。在電泳儀溫度控制板表面的邊線內加200ul蒸餾水或去離子水。凝膠面朝上,放置凝膠板,邊緣對齊邊線。略略將凝膠彎曲,然后放平,使水均勻分布在凝膠板下面而不含氣泡。
    9.7 降低支架,使緩沖條不接觸到凝膠板。
    9.8 從保溫盒里取出加樣器。取時拿保護框。折斷加樣器齒端保護框。將加樣器放在4號位置。
    9.9 關上電泳儀蓋子,按下鍵盤左側的綠色箭頭“START”鍵,電泳開始。
    9.10 凝膠染色掃描
    9.10.1 打開蓋子
    9.10.2 取出并丟棄加樣器
    9.10.3 升高兩個支架,握住塑料端取出并丟棄緩沖條。
    9.10.4 打開凝膠托架,平放,將干燥的凝膠片放入兩層間,然后關上托架。
    9.10.5 將凝膠支架放入染色池
    9.10.6 取出凝膠支架,打開蓋子,取出干燥的凝膠片。
    9.10.7在光密度儀的570nm處或以黃色濾光片掃描測定。使用HYDRYS,DVSE或PREFERENCE光密度儀時,使A2片段的標記置于掃描板5mm的標志處。
    10. 結果判斷與參考范圍
    掃描得到的只是每種血紅蛋白條帶的相對濃度值。取出膠片后,首先清潔膠片的背面。判斷溶血液的濃度是否合適,主要看基質帶的濃度,如基質帶濃度過淡,說明溶血液的濃度太淡。正常時A2濃度大約為基質帶濃度的1-2倍。
    半歲-成人:HbA≧94.5﹪,HbF﹤2.0%,HbA2﹤3.5%
    1個月:HbA 12-40﹪,HbF 60-93%,HbA2 0.1-1.0%
    6個月:HbA 86-98﹪,HbF 0.84-10.7%,HbA2 0.87-2.9%
    臍帶血:HbA 4-40﹪,HbF 30-96%,HbA2﹤1.0%
    11. 質量控制
    建議測定每一批樣本時都附有一控制品或含有血紅蛋白A,F,C和S的血樣本。
    12. 臨床意義
    12.1 檢測β-地中海貧血
    12.1.1 輕型:HbA2輕度升高,大多在4%-8%
    12.1.2 中間型:HbA1A2缺如,HbF可達10%
    12.1.3 重型:HbF:30%-90%,HbA多低于40%或甚至0%
    12.2 檢測α-地中海貧血
    12.2.1標準型α-地中海貧血:新生兒期HbBart′s可達5%-15%,幾個月后消失。經煌焦油藍溫育后,少數紅細胞內有H包涵體。血紅蛋白電泳無異常發現。
    12.2.2血紅蛋白H病:HbH在PH8.6或8.8電泳時,向陽極方向移動,泳速快于HbA;在PH6.5電泳時,仍向陽極方向移動。
    12.2.3 血紅蛋白Bart胎兒水腫綜合癥:Hb Bart′s占80%-100%,可有少量HbH。HbA、A2及F均缺如。
    12.3 檢測血紅蛋白病:引起臨床注意的異常血紅蛋白有四種:S,C,E和D。
    12.3.1 血紅蛋白S:在堿性緩沖條件下血紅蛋白S的條帶位于A和A2片段之間
    12.3.2血紅蛋白C:在堿性緩沖條件下血紅蛋白C,E和A2的條帶重疊在一起。若這一片段﹥15%,應懷疑有血紅蛋白C或E的異常。
    12.3.3 血紅蛋白E:與血紅蛋白C不同的是,E在酸性凝膠電泳中不與A2分離。
    12.3.4 血紅蛋白D:在堿性緩沖條件下,血紅蛋白D和S的條帶重疊在一起,但D在酸性凝膠電泳中不與A2分離。
    13. 操作性能:靈敏度高、特異性強、操作簡便,重復性好。
    14. 注意事項:
    14.1 試劑貯存于室溫(15~30℃)或冰箱(2~8℃)內,不能冷凍。
    14.2 不要應用溶血標本
    14.3若檢測到異常血紅蛋白,而又與常見的異常血紅蛋白S,C,D或E不同,可使用其他方法(如球蛋白鏈電泳)檢測,或求助于有關專門實驗室。
    14.4 HbF小于全部血紅蛋白的2%-3%時,掃描檢測HbF(或其它一些較少見的血紅蛋白)只是半定量的,結果不十分準確。
    14.5 對于中度或重度貧血的病例,點樣量應增大為15ul或20ul,其結果不受影響。
    14.6 電泳過程中不能打開蓋子。在染色脫色以及干燥過程中,儀器的一些程序處于鎖定狀態。
    14.7 最后染色后立即掃描測定。若欲保存,可用一保護物覆蓋后置于干燥、暗處,避免受熱,可保存約3個月。

     

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