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  • 高效液相色譜儀測定水產(chǎn)品中孔雀石綠

    發(fā)布于 2011/03/03閱讀(3712)來源 zxj

    摘要

    孔雀石綠(MG)為三苯甲烷類工業(yè)染料, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以有效的預防與治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小蟲病。

    內(nèi)容

    孔雀石綠(MG)為三苯甲烷類工業(yè)染料, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以有效的預防與治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小蟲病。并常用于魚苗的消毒。但一些水產(chǎn)品販運商為保持水產(chǎn)品新鮮度普遍用MG消毒車廂和活魚池;酒店為了延長魚的存活時間也在魚池中投放MG進行消毒。使用MG消毒后的魚即使死亡后顏色也較為鮮亮,消費者很難從外表進行辨認。MG在水生生物體中的主要代謝產(chǎn)物為無色孔雀石綠(LMG)。MG具有毒性強、高殘留和致畸、致癌、致突變等副作用。LMG由于不溶于水,其殘留毒性比MG更強。所以,目前世界上諸如美國、日本、加拿大和歐盟等許多國家已將MG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物,我國也于2002年5月將其列入“食品動物禁用的獸藥及其化合物清單”1。雖然MG已被列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物,但因為其價格低廉,同時目前在水霉病防治上尚無其它有效藥品,因此仍有一些水產(chǎn)養(yǎng)殖戶在普遍使用。
       各類水產(chǎn)品中MG和LMG的檢測是我國食品衛(wèi)生學面臨的新課題。為此,我國農(nóng)業(yè)部2004年頒布了水產(chǎn)品中MG殘留量測定的行業(yè)標準檢驗法-液相色譜法(SC/T3021-2004)2;國家質(zhì)量監(jiān)督檢疫總局和國家標準化管理委員會于2005年亦發(fā)布了“液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”和“高效液相色譜法”(GB/T19857-2005)3的標準檢驗法。Chang-Jun Cha等報道了(2001)采用氰基柱的反相高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)機檢測MG4。
    在上述分析方法中,SC/T3021-2004采用C18柱,等梯度洗脫方式,但需要較大流速(2ml/min);而 GB/T19857-2005法采用C18柱,梯度洗脫方式。文獻(4)采用氰基柱分離的梯度洗脫方式。我們在研究這些分析方法的基礎(chǔ)上,采用氰基柱分離、流速為1.0mL/min的等梯度洗脫方式,具有保留時間短、分離效果好、分析速度快、節(jié)省試劑;最低檢測濃度無LMG為0.02μg/mL,MG為0.05μg/mL。精密度高;特別是線性范圍達0.1μg/mL~160.0μg/mL,遠遠大于 SC/T3021-2004線性范圍(MG 0.01μg/m L~0.4μg/mL;LMG0.02μg/mL~0.40μg/mL)。而且,等梯度洗脫方式又擴大了液相色譜的應用范圍?,F(xiàn)將結(jié)果報告如下:
    1.      材料與方法
    1.     1材料
    1.1.1試劑
        乙睛 色譜純,fishte ;
        乙酸銨 ,hplc純 ,DIKMA;
        孔雀石綠(MG) sigma試劑;
        無色孔雀石綠(LMG)  sigma試劑。
    0.125mol/L乙酸銨溶液  稱取乙酸銨9.64 g,用純水溶解并定容至1000mL。用0.45μm濾膜過濾。
    MG標準儲備液  準確稱取孔雀石綠0.100 0g,用乙睛溶解并定容至100 mL。該標準溶液濃度為1mg/mL。避光、冰箱冷凍層保存。     
    MG標準應用液 吸取1mg/mL孔雀石綠標準儲備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。
    LMG標準儲備液 準確稱取孔雀石綠0.100 0g,用乙睛溶解并定容至100mL。該標準溶液濃度為1mg/mL。
        LMG標準應用液  吸取1mg/mL無色孔雀石綠標準儲備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。
    MG和LMG標準混合溶液  分別吸取MG和LMG標準儲備液,用乙睛稀釋成不同濃度的標準混合溶液。
    1.1.2 儀器
      高效液相色譜儀。
    1.2 步驟
    1.2.1 色譜條件
       檢測器  紫外-可見光檢測器,波長618nm;
       色譜柱  氰基柱,4.6mm×250mm,5μm;
       流動相  乙睛-0.125mol/L乙酸銨(pH4.5)=(47+53);
       柱溫  35℃;
       進樣量  20μL。
    1.2.2  測定步驟 
    吸取MG和LMG標準混合溶液(5.0μg/mL)注入色譜儀,在上述色譜條件下,繪制色譜圖。見圖1。
                   
                       圖1. 5.0μg/mL孔雀石綠和無色孔雀石綠
    標準混合溶液色譜圖
    2.結(jié)果與討論
    2.1流動相的選擇 MG和LMG的HPLC法分離,無論是C18柱還是氰基柱,多采用乙睛和乙酸銨作流動相的反相體系14。其中乙酸銨濃度對MG和LMG的分離有很大影響。對于梯度洗脫方式多采用50mmol/L乙酸銨溶液2、3,而等梯度洗脫方式乙酸銨溶液濃度較大(0.125mol/L)1。
    2.2 流動相溶劑比例的影響  在上述色譜條件下,用1.0μg/mL MG和LMG標準混合溶液在不同比例(V/V)乙睛-0.125mol/L乙酸銨溶液中觀察分離效果,結(jié)果表明,在乙睛-乙酸銨溶液(pH4.5)=47+53時分離效果好,靈敏度最高,所以選擇該溶劑比為流動相為。見表1。
                     表1       流動相溶劑比例對LMG/MG分離的影響
    ACN/0.125mol/L乙酸銨        LMG               MG            
         (V/V)            TR(min)  A        TR(min) A    ΔTR(min)     
         40/60            10.56     65364      15.06      94433     7.1
         45/55            9.06      66962      13.14      111812    4.1
         47/53            8.70      67011      11.21      11.5076    2.5
         50/50            7.25      56335      8.51       99594     1.3
         55/45            6.62      ——       7.08       ——      0.4
    2.3最低檢測濃度  在上述色譜條件下,以3S/N的響應信號為最低檢測濃度,LMG的最低檢測濃度為0.02μg/mL,MG的最低檢測濃度為0.05μg/mL。均能滿足試驗要求。見圖2。
    由圖可見,以取樣量10.0g計,最低檢測濃度LMG為2μg/kg,MG為5μg/kg。
     
                            
                                    圖2      LMG和MG最低檢測濃度
    2.4 線性范圍試驗  在上述色譜條件下,LMG和MG線性關(guān)系均良好。LMG和MG線性范圍為2μg/mL~160.0μg/mL,r >0.999。其中LMG和MG在0.2μg/mL~10.0μg/mL范圍的校正曲線見圖3;1.0μg/mL~160.0μg/mL范圍的校正曲線見圖4。
                             
                        
                    (a)                              (b)
       圖3 LMG(a)和MG(b)校正曲線1(0.2μg/mL~10.0μg/mL)
                                            
    (c)                                       (d)
    圖4  LMG(c)和MG(d)校正曲線2(1.0μg/mL~160.0μg/mL)
     
    2.5精密度試驗
    在上述色譜條件下,分別用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合標準溶液進行平行性測定。保留時間相對標準偏差(RSD)一般小于0.4%,峰面積相對標準偏差小于5%。見表2。
               表2 不同濃度LMG/MG混合標準溶液測定精密度試驗
           
            LMG/MG              LMG        MG
    (μg/mL)           TR    A     TR     A
              1.0                   9.13     94326   11.84   121590 
                                       9.11     91624   11.82   124395
                                       9.15     86984   11.82   126714
                                       9.10     94254   11.77   115168
                                       9.07     90030   11.73   115915
                                       9.12     88426   11.75   118041
    X                    9.11    90940    11.78   120303
    S                   0.02730  3023.7    0.04450  4695.3
    RSD(%)            0.3      3.3      0.4      3.9
    5.0                   9.01     346190  11.75   586155
                         8.91     334347   11.60   554314
                         8.89     350486   11.57   566958
                         9.07     337691   11.78   586993
                         9.06     333978   11.80   569882
                         9.01     328756   11.66   577275
    X                   8.99     338575   11.69    573596
    S                   0.07196  8198.3    0.09709  12493.2
    RSD(%)            0.8      2.4       0.8     2.2              
    10.0                 8.97     653769    11.63    1117447
                        9.03     689863     11.70    1147167
                        9.04     693111     11.71    1140571
                        9.00     681749     11.65    1264160
                        9.01     678101     11.67    1123467
    X                   9.01    679318.6    11.68    1158562
    S                   0.0270   15504.7     0.02750   60263
    RSD(%)             0.3       2.3         0.2     5.0          
    3樣品測定
    3.1 樣品處理
    3.2樣品測定
    3.2.1校正曲線的繪制
    3.2.2樣品測定
    3.3 加標回收率測定
    4結(jié)論
          LMG和MG毒性強、具有很高的三致作用,其對水產(chǎn)品的人為污染應受到嚴重關(guān)切。
    LC5500高效液相色譜儀測定水產(chǎn)品中LMG和MG,具有方法簡便、分離效果好、分析速度快、節(jié)省試劑、精密度高、靈敏準確、線性范圍寬等優(yōu)點,適用于水產(chǎn)品中LMG和MG含量檢測。

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