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  • HPLC分析樣品原則

    發(fā)布于 2011/04/20閱讀(2183)來(lái)源 zxj標(biāo)簽 液相分析

    摘要

    HPLC分析樣品的原則分析一個(gè)樣品,不是一拿來(lái)就試著用各種流動(dòng)相來(lái)分離,而是首先要分析樣品著手。

    內(nèi)容

    HPLC分析樣品原則:

    是否為高分子化合物、粘度大、具有生物活性的生物分子、有些或全部的樣品成分是否可電離(根據(jù)這樣條件可選擇色譜柱、流動(dòng)相、柱溫、流速、離子對(duì)試劑、是否需要預(yù)處理等等)......   具體分析:首先應(yīng)了解樣品的溶解性質(zhì),判斷樣品分子量的大小以及可能存在的分子結(jié)構(gòu)及分析特性,最后再選擇HPLC的分離模式,以完成對(duì)樣品的分析。  樣品的溶解度,由樣品在有機(jī)溶劑中溶解度的大小,初步判斷樣品是非極性化合物還是極性化合物,若樣品溶于非極性溶劑,表明樣品為非極性化合物,通常可以選吸附色譜法或正相分配色譜法、正相健合色譜法進(jìn)行分析。苦樣品溶于極性溶劑或相混溶的極性溶劑,表明樣品為極性化合物,通常選用反相分配色譜法或更為廣泛應(yīng)用的反相鍵合相色譜法進(jìn)行分析。若樣品溶于水相,可首先檢查水溶液的pH值,若呈中性為非離子型組分,常可用反相(或正相)鍵合相色譜法進(jìn)行分析。若pH 呈弱酸性,可采用抑制樣品電離的方法,在流動(dòng)相中加入硫酸、磷酸調(diào)節(jié)pH=2~3,再用反相鍵合相色譜法進(jìn)行分析。若pH呈弱堿性,則可向流動(dòng)相中加入陽(yáng)離子型反離子,再用離子對(duì)色譜法進(jìn)行分析。若pH呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性,則可用離子色譜法進(jìn)行分析。由于除去固定相中的離子對(duì)試劑較慢,當(dāng)改變流動(dòng)相時(shí),有時(shí)需要長(zhǎng)時(shí)間的平衡;再由于離子對(duì)試劑純度問(wèn)題,使離子對(duì)中的基線波動(dòng)問(wèn)題和干擾問(wèn)題現(xiàn)象比較常見。  優(yōu)化條件在于最終色譜圖中能產(chǎn)生出最嗌分開的譜峰。了解化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu),知道是否存在酸或堿,當(dāng)流動(dòng)相的pH值=混合物的平均pKa值或接近時(shí),可能會(huì)使分離較好。先優(yōu)化K;隨著容量因子的增加,譜峰會(huì)展寬,峰形變矮。(當(dāng)所有譜峰符合1<20的范圍時(shí),其流動(dòng)相已接近最佳了;再Α(≥1.05);最后優(yōu)化N,不同微粒的柱子均有一個(gè)最佳流速,流速再高會(huì)降低N值;如果降低流速,則會(huì)增加工作時(shí)間,但分離度會(huì)更好。當(dāng)流動(dòng)相粘度增加時(shí),N值也將降低;因此盡可能使用低粘度的溶劑。用最小RS法,另加常識(shí)(數(shù)一下峰!),在大多數(shù)情況下將是最佳方案。< p>   至于譜峰拖尾影響因素是很多的,可解決的辦法有:  在緩沖不好或離子強(qiáng)度過(guò)低的分離中,也會(huì)出現(xiàn)保留值重現(xiàn)性差和峰拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能大大改善此情況。柱子變得嚴(yán)重拖尾,甚至出現(xiàn)雙峰,通常是進(jìn)口濾板發(fā)生了部分堵塞或柱進(jìn)口處出現(xiàn)塌陷(可將空隙填滿接著反相沖洗柱子)。柱子出現(xiàn)峰展寬、拖尾則標(biāo)志著樣品中有保留性極強(qiáng)的“污物”在柱子的進(jìn)口處堆集起來(lái)。樣品在柱子上超載能引起峰展寬、拖尾(或伸舌)。通常減少進(jìn)樣量或提高檢測(cè)器靈敏度。  早出的峰拖尾最甚是儀器存在柱外效應(yīng)的最好佐證。要排除柱外效應(yīng),這不用我來(lái)說(shuō)了吧!   分析酸性或堿性組分,一般必須采用緩沖液流動(dòng)相。流動(dòng)相中無(wú)緩沖液,樣品組分在柱內(nèi)形成譜帶的哪一部分會(huì)引起流動(dòng)相pH增加或降低,樣品組分改變了電離程度,產(chǎn)生峰拖尾。緩沖液除了能改變峰形外,還能改變峰的保留。一般用中等偏高的濃度有利于減少峰拖尾(0.05~0.1mol/L)。  如還拖尾的話可加適量的修正劑! 

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